多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是临床常见的内分泌及代谢紊乱性疾病，病因尚不清楚，在育龄妇女中较为高发，以卵泡发育障碍、胰岛素抵抗和高雄激素血症为主要特征。PCOS是当代生殖医学领域研究的热点之一。当PCOS不孕患者经过标准促排卵治疗仍未妊娠，或合并其他助孕指征，可行体外受精-胚胎移植（IVF-ET）助孕治疗。在IVF控制性超促排卵（COH）过程中，常常在卵泡接近成熟时使用外源性人绒毛膜促性腺激素（hCG）以模拟内源性黄体生成素（LH）峰作用，促进卵泡最后的成熟，称为hCG扳机，因此，hCG扳机时间至关重要。临床上在至少3个主导卵泡径线≥17 mm或者2个主导卵泡径线≥18 mm时考虑行hCG扳机。扳机日除了要关注卵泡直径还应重视成熟卵泡数量，既要获得足够数量的成熟卵子又不降低卵子质量，目前国内外尚无统一标准。有研究认为妊娠率随着成熟卵泡比例的增加而升高，也有研究认为高成熟卵泡比例组卵子发育潜能反而降低。关于PCOS患者hCG注射日成熟卵泡比例对妊娠结局的影响研究甚少。2011年Genro等首次提出卵泡输出率（FORT）的概念，即hCG注射日双侧卵巢排卵前16~22 mm 卵泡个数与促排卵前2~8 mm窦卵泡个数的百分比，用于评估不孕患者卵巢反应性及妊娠结局。在COH周期中，同一批发育的径线稍小的卵泡（例如直径14~16 mm）也可获得成熟卵母细胞，hCG注射后这部分卵泡将会进一步发育成熟，因此本研究采用直径≥14 mm的卵泡数计算hCG注射日成熟卵泡数占比和FORT，并分析其对PCOS患者卵泡期长效长方案新鲜胚胎移植妊娠结局的影响，为控制性促排卵的治疗提供临床依据。
资料与方法
1.研究对象及分组：回顾性队列研究分析2017年5月至2018年5月期间在郑州大学第三附属医院生殖医学中心接受卵泡期长效长方案新鲜胚胎移植的PCOS患者的临床资料。纳入标准：①符合鹿特丹诊断标准，诊断为PCOS；②具有IVF/卵胞质内单精子注射（ICSI）指征；③卵泡期长效长方案降调节；④hCG扳机后取卵并行新鲜胚胎移植患者。排除标准：①子宫及卵巢手术史；②子宫内膜异位症；③子宫腺肌病；④双侧输卵管积水；⑤复发性自然流产等。根据hCG注射日直径≥14 mm卵泡数占比［（hCG注射日直径≥14 mm的卵泡数/hCG注射日卵泡总数）×100%］分为3组：A组，比例≤60%；B组，比例为60%~80%；C组，比例≥80%。根据FORT（hCG注射日直径≥14 mm的卵泡数/促排卵前窦卵泡总数×100%）分为3组：D组，比例≤40%；E组，比例为40%~60%；F组，比例≥60%。根据移植结局，将患者分为妊娠组及未妊娠组。本研究符合《赫尔辛基宣言》基本原则。
2.COH方案：所有患者均于月经周期第2~3日肌内注射长效促性腺激素释放激素激动剂（GnRH-a，达菲林，法国益普生）3.75 mg降调节，约于降调节30 d查血清激素［卵泡刺激素（FSH）、雌二醇、孕酮、LH］及阴道超声，若达降调节标准（FSH≤5 IU/L、LH≤5 IU/L、雌二醇<50 ng/L、孕酮<1 µg/L、内膜厚度≤5 mm、双侧窦卵泡直径≤5 mm），加用促性腺激素（Gn）进行COH，每日给予重组FSH（果纳芬，瑞士默克雪兰诺）促卵泡发育。根据患者的年龄、基础窦卵泡数（AFC）、生殖激素水平、体质量指数（BMI）和卵巢功能决定其起始剂量，根据卵泡发育情况适时添加人绝经期促性腺激素（hMG，珠海丽珠制药），根据卵泡发育大小及血清LH、雌二醇水平调整Gn用量和使用时间。
3.取卵、IVF及胚胎移植：患者双侧卵巢至少2枚卵泡直径达18~20 mm以上时，结合雌二醇水平确定“hCG扳机”时间，当晚皮下注射艾泽（瑞士默克雪兰诺）250 μg，注射后36~38 h 经阴道超声引导下取卵。取卵当日给予黄体支持，黄体酮凝胶（瑞士默克雪兰诺）1支/d阴道给药。同时男方取精，行IVF或ICSI授精，取卵后3~5 d行新鲜胚胎移植。新鲜胚胎移植后14 d检测血清β-hCG水平确定是否妊娠，若血清β-hCG≥5 IU/L，则判定为生化妊娠；移植后30~35 d行B超检查，超声下见孕囊为临床妊娠。
4.临床及实验室各项指标的观察：患者的一般情况，包括年龄、基础FSH（bFSH）、BMI、不孕年限和AFC。COH监测指标，包括Gn总量、Gn启动量、Gn使用时间、hCG注射日雌二醇、LH和孕酮水平。实验室指标，包括获卵数、双原核（2PN）受精率、可利用囊胚形成率（可利用囊胚为囊胚腔评分为3期及以上，内细胞团或滋养层细胞其中之一的评分高于C级的囊胚）、移植胚胎数、移植日子宫内膜厚度。胚胎移植结局监测指标，包括胚胎种植率、临床妊娠率、流产率、活产率和卵巢过度刺激综合征（OHSS）发生率等。2PN受精率=2PN数/获卵数×100%；可利用囊胚形成率=可利用囊胚形成数/囊胚培养数×100%；胚胎种植率=超声见孕囊数/移植胚胎数×100%；临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期数×100%；流产率=流产周期数/移植周期数×100%；活产率=活产周期数/移植周期数×100%；OHSS发生率=OHSS发生周期数/移植周期数×100%。
5.统计学方法：采用SPSS21.0统计学软件进行分析，计量资料符合正态分布时以均数±标准差（Mean±SD）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验；计数资料以率（%）表示，组间比较采用χ2检验。临床妊娠的影响因素分析采用二元logistic回归分析法。P<0.05表示差异有统计学意义。
结果
1. hCG注射日直径≥14 mm卵泡占比分组各项指标的比较：A组的Gn使用时间与Gn总用量大于B组和C组（P<0.001），但Gn启动剂量低于B组和C组（P=0.026），B组和C组间差异均无统计学意义（P>0.05）。hCG注射日雌二醇水平、hCG注射日孕酮水平及获卵数随着hCG注射日直径≥14 mm卵泡数占比的增加而增加（P<0.001）。A组2PN受精率小于B组（P=0.013），余组间差异无统计学意义（P>0.05）。3组间可利用囊胚率、胚胎种植率、临床妊娠率、流产率、活产率差异均无统计学意义（P>0.05）；C组的OHSS发生率显著大于A组（P=0.008），余组间比较差异无统计学意义（P>0.05）（表1）。
2. 根据FORT分组各项指标的比较：D组的Gn使用时间与Gn总用量大于E组和F组（P<0.001），F组的Gn启动剂量大于E组和F组（P=0.019）；随着FORT的增加，hCG注射日雌二醇水平、hCG注射日孕酮水平及获卵数随之增加（P<0.001）；F组2PN受精率明显低于D组（P=0.009）和E组（P<0.001），D组与E组间差异无统计学意义（P>0.05）；F组胚胎种植率、临床妊娠率、活产率低于E组（P=0.002、P=0.007、P=0.011），D组与其他两组比较差异无统计学意义（P>0.05）；F组的OHSS发生率显著大于D组（P=0.010），余组间比较差异无统计学意义（P>0.05）（表2）。
3. 妊娠组与未妊娠组临床及实验室各项指标的比较：妊娠组2PN受精率和可利用囊胚率高于未妊娠组（P=0.041，P<0.001）；未妊娠组FORT高于妊娠组（P=0.031），而hCG注射
日直径≥14 mm卵泡数占比组间差异无统计学意义（P>0.05）；在年龄、BMI、AFC、获卵数等方面，两组比较差异无统计学意义（P>0.05）（表3）。
4. 影响临床妊娠相关因素的二元logistic回归分析：以临床妊娠与否为因变量，校正混杂因素（年龄、AFC、获卵数、2PN受精率、可利用囊胚率等）后结果显示AFC、可利用囊胚率、FORT对临床妊娠的影响有统计学意义，其余指标对临床妊娠结局的影响无统计学意义（表4）。
讨论
PCOS不孕患者首要的治疗方法是诱发排卵，当通过调整生活方式与促排卵失败时，或当患者合并有其他助孕指征时，可以考虑进行IVF治疗。由于PCOS患者特殊的内分泌紊乱，其对药物的反应性无法预测，在促排卵的过程中容易出现多卵泡发育、卵子质量下降、OHSS等风险，或者对促排卵药物不反应或卵泡期过长，提早黄素化等，合适的COH方案及hCG扳机时机至关重要。本研究分别按hCG注射日直径≥14 mm卵泡数占比和FORT分为高、中及低比例组，研究各组对卵泡期长效长方案新鲜胚胎移植妊娠结局的影响。
先前的研究以及临床治疗中，多采用年龄、AFC、bFSH、抗苗勒管激素（AMH）等指标来预测卵巢的反应性及妊娠结局，Genro于2011年最早提出了FORT的概念，并将其用之于临床。Rehman等和Gallot等认为，FORT可以预测获卵数、胚胎质量及妊娠结局。Hassan等认为，FORT是影响临床妊娠率的独立因素，随着FORT值增大，获卵数和优质胚胎数增加，种植率和妊娠率增高。Zhang等认为PCOS患者的中比例FORT和非PCOS患者的高比例FORT可以得到更好的妊娠结局，这与卵巢反应异质性有关。本研究显示妊娠组FORT显著低于未妊娠组，FORT高比例组（F组）2PN受精率低于FORT中、低比例组（D和E组），FORT高比例组（F组）临床妊娠率及活产率低于FORT中比例组（D组），得知中、低比例的FORT可获得较好的妊娠结局。卵巢功能正常的患者窦卵泡数相对有限，FSH受体饱和后，产生的雌激素量与之相对应，雌激素分泌高峰维持24 h左右后逐渐下降。PCOS患者的AFC是正常患者的2~3倍，Gn刺激大量卵巢颗粒细胞分泌雌二醇，使其剂量明显增加，雌激素的分泌在达到峰浓度之后会呈现显著下降趋势。有学者认为注射hCG前雌激素的下降与卵泡闭锁或提前黄素化有关，最终导致低受精率和卵裂率，故妊娠率降低。hCG注射日高浓度雌二醇水平也可能通过影响卵子质量、胚胎发育或子宫内膜容受性影响辅助生殖的结局。以往文献指出高雌激素患者虽可获得较多卵子，但会产生不成熟或过熟卵子，这些卵子受精后分裂不佳，形成低质量胚胎；一个COH周期有过多的卵子发育成熟，可能使质量差的卵子比例增高，导致可利用胚胎率降低。另外高FORT组大卵泡比例增高，当卵泡超过一定径线时容易出现黄素化和卵母细胞老化，从而导致卵母细胞质量下降，优质胚胎数目减少，并最终影响患者的妊娠结局。过高的血清雌二醇水平可以改变与着床密切相关的分子、发育基因以及子宫内膜超微结构的时序性表达，使子宫内膜组织学变化与正常生理改变不符，导致腺体发育和间质发育的不同步，使种植窗的开放与胚泡的发育不同步，影响胚胎着床，最终影响妊娠结局。
有研究表明在GnRH-a长方案中，hCG注射日成熟卵泡比例（≥18 mm/≥10 mm）对PCOS患者临床妊娠结局无影响，延迟hCG扳机时间可能会增加OHSS的风险，这与本研究结论一致。本研究结果显示随着hCG注射日卵泡直径≥14 mm数占比升高，获卵数增加，可移植胚胎数随之增加，可能会提高累积妊娠率，但不影响临床妊娠率和活产率。在COH过程中，使用促排卵药物刺激多个卵泡共同发育，由于每个卵泡对FSH的敏感性不同，对FSH敏感的卵泡逐渐发育成优势卵泡，其他卵泡则可能发育缓慢或逐渐闭锁。因此hCG注射日监测到的卵泡总数一般低于AFC，这使hCG注射日直径≥14 mm卵泡数占比相较于FORT比例重新分配，得出不一样的结论。数据分析可见在hCG注射日卵泡直径占比分组下，各组数据差距较FORT分组小，高比例组与FORT中比例组的获卵数、临床妊娠率及活产率相近。得知卵泡直径占比这种分组方式缩小了组间差异，对临床妊娠率和活产率没有明显影响。
除了FORT可预测妊娠结局，logistic回归分析提示AFC与临床妊娠密切相关。Holte等的大样本前瞻性研究结果显示PCOS患者助孕治疗后的妊娠率及活产率与AFC呈线性正相关。另有研究表明，PCOS患者的获卵数虽然在增加，但卵母细胞的质量较差，从而导致受精率、卵裂率和种植率降低。这可能是因为卵巢内因素［表皮生长因子（EGF）、成纤维生长因子（FGFs）、胰岛素样生长因子（IGF）家族、神经生长因子（NGF）家族、转化生长因子（TGF）-β家族、血管内皮生长因子（VEGF）家族、细胞因子家族］和卵巢外因素（FSH缺乏、高LH、高雄激素、高胰岛素）对卵母细胞的成熟和胚胎潜在发育能力产生负面影响。回归分析还表明获卵数与临床妊娠关系不大，可能因为PCOS患者促排卵后能获得可观的胚胎数量，选择优质胚胎进行移植是IVF成功的关键。在IVF过程中，仍要注意把握卵巢刺激的强度，不宜过多或过少，不仅要使患者一次取卵周期获益最大化，同时要兼顾胚胎利用率、OHSS风险等方面，制定个体化的促排卵方案。
目前应用于PCOS患者的促排卵药物及促排卵方案较多。随着临床研究的深入，COH方案在长方案基础上又衍生出拮抗剂方案、微刺激方案、长效长方案、超长方案等，各个方案各有其优劣势。本研究仅选取行卵泡期长效长方案降调节的患者进行研究，其他方案值得进一步探讨。卵泡期长效长方案通过充分降调节，更理想地控制了PCOS患者异常激素水平，尽可能使多的卵泡发育成熟，同时推迟注射hCG可获得更多的成熟卵子，发生黄素化概率低，对子宫内膜容受性的影响小，但获卵数的增多，亦会增加OHSS的风险［23］。PCOS是发生OHSS的高危因素之一，目前OHSS缺乏针对性强的治疗方法，预防尤为重要。对PCOS患者，应当减少Gn用量；当卵泡近成熟，血清雌激素水平过高时，可短暂停用Gn，也称“coasting”；出现严重OHSS倾向时，可取消周期；减少hCG的扳机剂量，取卵后禁用hCG进行黄体支持等。这些方法都能一定程度降低OHSS的发生率。阿司匹林、二甲双胍等药物的使用也可预防OHSS的发生。另外，妊娠导致内源性hCG大量分泌，可诱发加重OHSS的发生发展，选择性的全部胚胎冷冻可以避免因妊娠而引起的迟发型OHSS。对于已发生OHSS的患者，应积极对症治疗，减少严重并发症的发生，以减轻患者痛苦，最终实现患者的生育目的。
综上所述，在PCOS患者中，hCG注射日直径≥14 mm卵泡数占比不影响妊娠结局，FORT对于预测妊娠结局具有重要意义，中低比例FORT的患者可有较好的妊娠结局。本研究仅为回顾性研究，仍有待大样本、多中心、前瞻性研究进一步证实。
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